Interactions physiques de bicouches lipidiques déposées sur un coussin de polymères pour l'incorporation de protéines
Physical interactions of cushioned supported lipid bilayers for protein incorporation
Résumé
Solid Supported membranes, lipid bilayers that are directly deposited on a solid substrate, are generally used as models of biological membranes for the study of membrane interactions involving proteins and receptors. A primary problem with these model membranes is the fact that transmembrane proteins cannot interact physiologically due to unfavourable interactions induced by the proximity of the solid support. To solve this problem, we have developed a cushioned supported bilayer system that is compatible with the incorporation of integral membrane proteins in a laterally mobile form. We use a lipid bilayer on a thin polyethylene glycol (PEG) polymer cushion, which provides a soft support, and for increased stability, covalent linkage of the membranes to the solid substrate mediated by the PEG. The bilayers were formed on solid substrates like mica or glass using Langmuir Blodgett deposition technique: a first monolayer composed of silane-PEG-lipid (10%) and lipid (90%) was deposited, followed by a second lipid (100%) monolayer. Their morphology was observed using ultra-high resolution atomic force microscopy (AFM). We observed no structural defects on these cushion supported bilayers at a subnanometric scale. The lateral diffusion of the lipids in the bilayer was monitored by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Depending on the phase of the lipids (gel or fluid) within each layer of the membrane, we observed an increase in lateral diffusion coefficients (from 1.9 to 4.3 x108 cm²/s) upon going from gel like lipids to fluid like lipids at room temperature.Using the surface force apparatus (SFA), we were able to observe the interaction of these membrane models in different configurations (bilayers in a gel or fluid phase, symmetric or asymmetric configuration of the interacting surfaces in the SFA). The measurements show that the thickness of the polymer cushion was ~20 nm in an aqueous medium. They also show that hemifusion between the membranes (where the outer layer of each membrane fuse and move into the aqueous reservoir in order to bring only the inner layers into contact) occurs only when there are fluid lipids in both the inner and outer leaflets. Then, one protein, Synaptotagmin-1 (Syt1), was attached to the cushioned lipid bilayer. This protein has been shown to bind to the lipids of an opposing membrane in previous experiments on solid supported membranes. The measurements made with Syt1 anchored to the cushioned lipid bilayer reveal a lowering of the energy per molecule compared to the previous study done with solid supported lipid bilayer model; from 17.6 ± 1.4 kBT on solid supported membrane to 2.7 ± 0.6 kBT on cushioned bilayer. This suggests that during the separation of the lenses, the polymer and the proteins are stretched before separating and the lost energy is dissipated into the polymer extension. The work in this project gives us an initial start on building a cushioned supported lipid bilayer with transmembrane proteins incorporated in them.
Les membranes à support solide sont des bicouches lipidiques déposées directement sur un substrat solide. Elles sont généralement utilisées comme modèles de membranes biologiques pour l’étude des interactions membranaires comprenant des protéines et des récepteurs. Un problème majeur de ces modèles de membranes est le fait que les protéines transmembranaires ne peuvent pas interagir physiologiquement en raison des interactions défavorables induites par la proximité du support solide. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un système de membranes sur coussin de polymères compatible avec l’incorporation intégrale de protéines transmembranaires avec une mobilité latérale. Nous utilisons une bicouche lipidique sur un coussin mince de polymère de polyéthylène glycol (PEG), qui constitue un support souple et, avec une bonne stabilité grâce à la liaison covalente des membranes au substrat solide par l’intermédiaire du PEG. Les bicouches ont été formées sur des substrats solides tels que le mica ou le verre selon la technique de dépôt de Langmuir Blodgett: une première monocouche composée de silane-PEG-lipide (10%) et de lipide (90%) a été déposée, suivie d'une seconde couche lipidique (100%). Leur morphologie a été observée en utilisant la microscopie à force atomique à ultra haute résolution (AFM). Nous n’avons observé aucun défaut de structure à l’échelle sub-nanométrique sur ces bicouches sur coussin de polymère. La diffusion latérale des lipides dans la bicouche a été mesurée par recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Selon la phase des lipides (gel ou fluide) dans chaque couche de la membrane, nous avons observé une augmentation des coefficients de diffusion latérale (de 1,9 à 4,3 x108 cm² / s) en allant de la phase gel à la phase fluide à température ambiante.En utilisant l'appareil de force de surface (SFA), nous avons pu observer l'interaction de ces modèles de membrane dans différentes configurations (bicouches dans l’état gel ou fluide, configuration symétrique ou asymétrique des surfaces en interaction dans le SFA). Les mesures montrent que l'épaisseur du coussin de polymère était d'environ 20 nm en milieu aqueux. Elles montrent également que l'hémifusion entre les membranes (où la couche externe de chaque membrane fusionne et se déplacent dans le réservoir aqueux afin de ne mettre en contact que les couches internes) ne se produit que lorsque les lipides sont fluides dans les couches interne et externe. Une protéine, Synaptotagmin-1 (Syt1), a ensuite été ancrée sur la bicouche sur coussin de polymère. Il a été démontré que cette protéine se liait aux lipides d’une membrane opposé lors d’expériences précédentes sur des membranes à support solide. Les mesures effectuées avec des protéines ancrées à la bicouche de lipides sur coussin polymérique révèlent une diminution de l'énergie par molécule de l'étude précédente réalisée avec un modèle de bicouche de lipide à support solide : de 17,6 ± 1,4 kBT pour la bicouche supportée à 2,7 ± 0,6 kBT pour la bicouche sur coussin. Ceci suggère que lors de la séparation des lentilles, le polymère et les protéines sont étirés au moment de la séparation et que l'énergie perdue est dissipée dans l'extension du polymère. Les travaux menés dans le cadre de ce projet nous donnent une première étape dans la construction d’une couche lipidique sur coussin polymérique avec des protéines transmembranaires incorporées.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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